Test RealPCR per il SARS-CoV-2 (COVID-19) di IDEXX

Convalida analitica e studi di specificità incrociata

I laboratori di riferimento IDEXX hanno sviluppato un nuovo test della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RealPCR) per rilevare il SARS-CoV-2 (COVID-19) sulla base di un allineamento unico alle sequenze genetiche del virus pubblicate provenienti dall’epidemia umana. Il test IDEXX RealPCR per il SARS-CoV-2 (COVID-19) ha soddisfatto tutti i requisiti di convalida analitica. Gli studi di specificità hanno mostrato l’assenza di reattività incrociata con il nuovo test di PCR ai coronavirus veterinari comuni che interessano gli animali da compagnia. Analogamente, i test RealPCR attualmente disponibili per questi coronavirus veterinari hanno dimostrato di non rilevare l’acido nucleico COVID-19 sintetico. I test RealPCR di IDEXX sono concepiti ed effettuati su una piattaforma PCR in tempo reale standard nel laboratorio di diagnostica molecolare (PCR) di West Sacramento in California. Oltre 4000 campioni canini, felini ed equini sono stati esaminati con il nuovo test RealPCR per il SARS-CoV-2 (COVID-19) di IDEXX. I campioni dei pazienti sono stati raccolti su un periodo di quattro settimane a iniziare dal 14 febbraio 2020. I campioni utilizzati per lo sviluppo e la validazione del test sono stati ottenuti da campioni inviati ai Laboratori di Riferimento IDEXX per i test respiratori RealPCR. I campioni provenivano dagli Stati Uniti e dalla Corea del Sud e includevano esemplari che provenivano da regioni colpite da casi di COVID-19 nell'uomo, come l’area di Seattle. I campioni sono stati inoltre testati in parallelo con tre esami dai Centri per la Prevenzione e il Controllo delle Malattie (CDC). IDEXX ha ora esteso il monitoraggio in Canada e nei paesi Europei, comprese le aree che presentano alti tassi di COVID-19 nell'uomo. Ad oggi, tutti i campioni testati per COVID-19 sono risultati negativi.

Design dell’analisi e convalida analitica

Il test RealPCR per il SARS-CoV-2 (COVID-19) di IDEXX ha come target lo stesso gene del nucleocapside utilizzato nelle analisi CDC. Questo target è stato basato sull’analisi di sequenze indicante elevata conservazione e adattato in funzione del punto di fusione e dei requisiti analitici della nostra piattaforma standardizzata. La convalida del test ha in primo luogo comportato l’analisi BLAST di sequenze, confrontando oltre 300 sequenze genetiche disponibili in banche dati pubbliche. In secondo luogo, è stato utilizzato un controllo positivo sintetico per convalidare funzionalmente l’analisi in termini di performance, che ha soddisfatto i requisiti di robusto rapporto segnale/rumore durante l’efficacia di amplificazione, riproducibilità nella corsa (intra-run) e tra corse (inter-run) e correlazione. In aggiunta, IDEXX ha implementato tre analisi CDC svolte in parallelo all’analisi IDEXX a fini di conferma. Le tre analisi di conferma sono state adottate dalle analisi CDC, pubblicate originalmente il 24 gennaio 2020.1,2

La specificità incrociata di tutte e quattro le analisi (SARS-COV-2) è stata confermata utilizzando target di coronavirus veterinari positivi al test sintetico e campioni positivi alla PCR di coronavirus respiratori canini, coronavirus enterici canini e felini e coronavirus enterici equini trasmessi mediante l’offerta diagnostica IDEXX. I seguenti controlli sono stati inclusi durante la fase di convalida della PCR in tempo reale e screening. 

  • Controllo negativo di estrazione (NEC): tutti i controlli negativi di estrazione hanno dato risultato negativo alla PCR.
  • Controllo di qualità dei campioni in fase preanalitica utilizzando un’analisi PCR TaqMan® in tempo reale per un gene di controllo endogeno. Tutti i campioni, sia di carattere negativo che positivo, hanno passato il controllo di qualità dei campioni.
  • Controlli negativi di PCR: tutti i controlli negativi della PCR hanno dato risultato negativo.
  • Controlli positivi di PCR: tutti i controlli positivi della PCR (controllo positivo sintetico) hanno dato risultato positivo.
  • Monitoraggio della contaminazione ambientale: tutti i campioni di varia provenienza all’interno del laboratorio PCR hanno dato risultato negativo al monitoraggio della contaminazione.

I campioni di coronavirus respiratorio canino, coronavirus enterico canino e felino e coronavirus enterico equino positivi alla PCR, che sono stati trasmessi mediante l’offerta diagnostica IDEXX, sono altresì stati sottoposti a screening a fronte di tutte le analisi SARS-CoV-2. Tutte le analisi CDC e analisi IDEXX RealPCR per il SARS-CoV-2 (COVID-19) sono risultate negative al test su questa popolazione di altri coronavirus.

Metodologia di screening

Sono stati utilizzati campioni a caso tra i campioni di coronavirus respiratorio canino, respiratorio felino, respiratorio equino, diarrea felina, diarrea canina e diarrea equina trasmessi mediante l’offerta diagnostica di IDEXX RealPCR. I campioni iniziali utilizzati per lo screening hanno incluso tamponi (in maggioranza tamponi [gola] faringei profondi e tamponi [occhi] congiuntivali) e feci. Sugli oltre 4000 campioni sottoposti a screening tra il 14 febbraio e il 12 marzo:

  • i campioni sottoposti a screening sono provenuti da tutti i 50 stati americani e dalla Corea del Sud;
  • il 55% dei campioni era di provenienza canina, il 41% di provenienza felina e il 4% di provenienza equina;
  • il 77% erano campioni respiratori, il 23% fecali.

 

Bibliografia

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. Pubblicazione CDC: CDC-006-00019, Revisione: 02. www.fda.gov/media/134922/download. In vigore dal 15 marzo 2020. Accesso ottenuto il 16 marzo 2020.
  2.  Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Research Use Only Real-Time RT-PCR Protocol for Identification of 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Aggiornato il 14 marzo 2020. Accesso ottenuto il 16 marzo 2020.

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